Elektroforeza DNA w żelu

Cząsteczki DNA posiadają na swojej powierzchni ładunek ujemny, poruszają się przez podłoże (żel agarozowy lub poliakrylowy) w kierunku elektrody, posiadającej przeciwny ładunek niż rozdzielane cząsteczki. Zadaniem żelu jest zapobieganie dyfuzji oraz stabilizacja pH. Szybkość migracji cząsteczek w żelu agarozowym zależy m.in. od różnicy potencjałów między elektrodami, od oporu środowiska(nośnika), tj. od lepkości żelu oraz od stężenia elekrolitu (buforu), jego pH i temperatury oraz masy cząsteczkowej DNA. Cząsteczki DNA liniowe migrują w tempie, które jest odwrotnie proporcjonalne do log₁₀ ich masy cząsteczkowej. Tempo poruszania cząsteczek DNA zależy także od stężenia agarozy. Im jest ono wyższe, tym szybkość poruszania cząsteczek DNA jest mniejsza. Można powiedzieć, że elektroforeza funkcjonuje na zasadzie sita molekularnego, gdzie krótsze cząsteczki wędrują szybciej, dłuższe –wolniej. W stężeniu agarozy w żelu 0,3 rozdzielane jest  liniowe DNA w zakresie 5-60 [kpz], w stężeniu 0,9 liniowe DNS w zakresie 0,5-7 [kpz], zaś w stężeniu 2,0 zakres rozdziału liniowego DNA wynosi 0,1-2 [kpz]. Tempo wędrówki DNA jest zależne także od jego konformacji. Superzwinięte cząsteczki DNA, cząsteczki DNA naciętego kolistego i DNA liniowego  o tej samej masie migrują w żelu .

Aby zidentyfikować wielkość cząsteczek DNA w prążkach, na żel nakłada się standardy wielkości (wzorzec mas), migruje w żelu równolegle z analizowaną próbką i pozwala zorientować się , czy został otrzymany pożądany produkt. Poprzez porównanie prążków  z badanej próbki z prążkami standardu jesteśmy w stanie określić wielkość cząsteczek DNA w badanej próbce. Wzorzec mas to fragmenty o ustalonej wielkości, zazwyczaj jest to wyizolowany DNA fagów pocięty odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi.

Próbki DNA, które nakładamy na żel zawierają barwnik, który nie barwi DNA, jedynie ułatwia nam nakładanie próbek do studzienek w żelu. Migracja barwinka jest ściśle skorelowana z migracją cząsteczek DNA, ułatwiając w ten sposób obserwowanie prawidłowośći i postępu rozdziału. Aby zobaczyć wynik rozdziału DNA na żelu agarozowym należy żel wybarwić w substancji, która wiąże się z kwasem deoksynukleinowym. Wizualizacja cząsteczek DNA następuje w świetle promieni UV dzięki barwnikom, najczęściej stosowany jest bromek etydyny (bromek 2,7-diaminino-N-etylo-6-fenylo-fenantrydyny). Dodany do żelu wbudowuje się miedzy zasady DNA, a następnie po nad wpływem światła UV świeci. Fluorescencja kompleksu bromek etydyny-DNA jest wyższa dziesięciokrotnie od fluorescencji samego bromku.

Zaletą techniki elektroforetycznej jest jej prostota, szybkość i cena (jest stosunkowo tania stąd–rutynowo stosowana jest w laboratoriach

ŹRÓDŁO (AUTOR)

Nowak Z. Gruszyczyńska J. 2007. Wybrane techniki i metody analizy DNA. Wydawnictwo SGGW.

Polak-Berecka M. 2006. Genetyka populacyjna drzew leśnych. Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Krakowie

Publikacje powiązane tematycznie

Nowak Z. Gruszyczyńska J. 2007. Wybrane techniki i metody analizy DNA. Wydawnictwo SGGW.

Polak-Berecka M. 2006. Genetyka populacyjna drzew leśnych. Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Krakowie