Łańcuchowa reakcja polimerazy

Startery oligonukleotydowe zapewniają specyficzność reakcji PCR. Sa to krótkie, jednoniciowe fragmenty DNA o długości ok. 10-20 par zasad o sekwencjach komplementarnych do sekwencji otaczającej namnażany fragment DNA. Z czterech różnych nukleotydów możemy ułożyć 4ⁿ różnych n-nukleotydowych sekwencji. Dwudziestonukleotydowy fragment posiada niewyobrażalną liczbę ko genie. Do PCR potrzebna jest para starterów ograniczających długość syntetyzowanego łańcucha z dwóch stron (forward, reverse) Statery umożliwiają enzymowi polimerazie DNA związanie się i rozpoczęcie działania.

Termostabilna polimeraza- enzym pochodzący z bakterii Thermus aquaticus (Taq). Bakterie te zostały wyizolowane w 1969 r. z gorących źródeł Yellowstone, a 6 lat później wyizolowano z nich polimerazę Taq. Charakterystyczną właściwością polimerazy jest termostabilność w zakresie 37-94^oC, nie traci swych właściwości w temperaturze denaturacji dla innych białek, jest ona oporna na wysokie temperatury panujące w mieszaninie reakcyjnej (Termostabilność polimerazy Taq stała się podstawą metody PC. Polimeraza jest izolowana z także Thermus thermophilus , ale także z rekombinata Escherichia coli. Jest odpowiedzialna za dołączanie nukleotydów do nici DNA.

Trifosforany nukleozydów (dNTP: gdzie N to adenina, guanina, cytozyna lub tymina)- sa to aktywne formy nukleotydów budujących DNA. Podczas wydłużania się nowej nici dwie reszty kwasu fosforowego są odłączane i nukleotyd zostaje wbudowany w potomną nić DNA.

Bufor do reakcji PCR- zawiera w swoim składzie Tris Cl, KCl, (NH₄)₂SO₄ i MgCl_2. I ma na celu zapewnienie odpowiedniego środowiska reakcji. Ważny jest jego odczyn oraz stężenie jonów- w szczególności jonów magnezu, które wpływają na wydajność działania polimerazy , szybkość dołączania nuleozydów oraz prawidłowy przebieg hybrydyzacji między starterami a matrycą. Dokładność reakcji PCR jest wprost proporcjonalna do stężenia wolnych jonów magnezu, ich stężenie powinno nieco przewyższać stężenie dNTP, co zwiększa dokładność polimerazy.

Wszystkie składniki zmieszane w odpowiednich proporcjach i ilości umieszcza się w próbówkach w termocyklerze. Reakcję PCR powinno się wykonywać w obecności tzw. kontroli pozytywnej i negatywnej. Powielenie DNA metoda PCR przebiega s powtarzających się trzyetapowych cyklach. Dla każdego etapu reakcji PCR niezwykle ważne jest ustalenie wartości dwóch parametrów: temperatury i czasu trwania etapu.

Etap 1- denaturacja matrycy (dwuniciowego DNA) - 30 s - 1 min. Rozplecenie podwójnej helisy DNA na dwie osobne nici niezbędne jest aby w następnym etapie mogły się przyłączyć startery. Osiąga się to poprzez denaturację termiczną, mieszanina reakcyjna jest podgrzewana do 93 - 100⁰C.

Etap 2- hybrydyzacja komplementarna – 30 s- 1 min. Przyłączenie starterów do wcześniej rozdzielonych nici DNA. Temperatura w czasie trwania etapu wynosi między 37- 65⁰C.

Etap 3- wydłużanie staterów – ok. 1 min. Synteza nowej nici DNA . Ten etap przebiega w temperaturze optymalnej dla użytej polimerazy (dla polimerazy Taq , optymalna temperatura wynosi 72^oC.

Przytoczone parametry są przykładowe, w rzeczywistości czas trwania poszczególnych etapów reakcji, liczba cykli, wartości temperatury oraz stężeń substratów są w szerokich granicach modyfikowane w różnych wariantach PCR.

Całość procesu PCR składa się zwykle z kilkudziesięciu cykli, termocykler programuje się przeciętnie na 30-30 cykli amplifikacji. W pierwszym cyklu produkty wydłużania startera powstają na bazie matrycy DNA wykorzystanej do reakcji, w drugim cyklu produkty powstają w wyniku syntezy DNA po denaturacji pierwszorzędowych produktów, dopiero w trzecim cyklu pojawiają się po raz pierwszy fragmenty o odpowiedniej długości, zdeterminowanej przez sekwencje starterów. Od tego momentu zaczyna się wykładnicza synteza fragmentów DNA, po 30 cyklach reakcji z 1 kopii matrycy DNA powstanie 1 073 741 764 kopii DNA. Powielone fragmenty DNA są następnie analizowane metodą elektroforezy. W zależności od wielkości amplifikowanych fragmentów DNA można zastosować rozdział na żelu agarozowym (dla dużych cząstek) lub w denaturującym żelu poliakrylamidowym (dla fragmentów krótszych).

Na podstawie standardowej procedury PCR powstało wiele modyfikacji, które pozwalają polepszyć możliwości badawcze.

ŹRÓDŁO (AUTOR)

Nowak Z. Gruszyczyńska J. 2007. Wybrane techniki i metody analizy DNA. Wydawnictwo SGGW.

Polak-Berecka. 2006. Genetyka populacyjna drzew leśnych. Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Krakowie

Publikacje powiązane tematycznie

Nowak Z. Gruszyczyńska J. 2007. Wybrane techniki i metody analizy DNA. Wydawnictwo SGGW.

Polak-Berecka. 2006. Genetyka populacyjna drzew leśnych. Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Krakowie