Sekwencjonowanie DNA

Pierwszym sukcesem w dziedzinie sekwencjonowania DNA było ukazanie się w  roku 1968, przez Wu i Kaiser sekwencji „lepkiego końca” DNA faga λ. Była to metoda sekwencjonowania żmudna i pracochłonna, jednak było to jak na tamte czasy ogromne osiągniecie. Szybkie i wydajne procedury sekwencjonowania kwasów nukleinowych powstały w drugiej połowie lat 70 – tych XX w. Prawie w tym samym okresie zostały przedstawione dwie techniki umożliwiające poznanie sekwencji zasad w DNA. Jedna zwana metodą chemicznej degradacji łańcucha DNA zaproponowana została przez Maxama i Gilberta, druga zaś to metoda terminacji łańcucha stworzona przez zespół Sangera. Początkowo obie te metody cieszyły się podobnę popularnością i obie do tej pory stosowane są w wielu laboratoriach. Jednakże po latach to metoda Sangera stała się powszechniej stosowaną, m. in. ze względu na możliwość jej automatyzacji.

Najczęściej stosowana metoda sekwencjonowania polega na syntezie komplementarnych kopii jednej nici za pomocą polimerazy DNA, która przy udziale starterów katalizuje syntezę DNA w obecności didezoksynukleotydów (ddNTP) (zmodyfikowanych nukleotydów, które nie posiadają grupy 3’-hydroksylowej i z tego powodu blokują dalsze wydłużanie się nowego łańcucha). W celu sekwencjonowania fragmentu DNA potrzebne jest użycie czterech różnych mieszanin reakcyjnych, z których każda posiada małą ilość tylko jednego rodzaju didezoksynukleotydu (np. didezoksy-ATP) oraz dużą ilość czterech normalnych dezoksynukleotydów. W wyniku włączania się didezoksy -ATP (-GTO, -TP, -TTP) do rosnącego łańcucha w przypadkowych miejscach, powstają mniejsze fragmenty DNA, kończących się w tam, gdzie występowała adenina (guanina, cytozyna lub tymina). Po zakończonej reakcji, trwającej zwykle 25-30 cykli, otrzymujemy wiele produktów różnej długości, mających zawsze ten sam początek (starter). Wszystkie powstałe fragmenty w zależności od tego, w której z czterech próbówek były syntetyzowane, na końcu 5’ mają wyznakowany zawsze ten sam starter, zaś na końcu 3’ wyznakowany tylko jeden z czterech didezoksynukleotydów. W reakcji stosuje się znakowane startery, aby umożliwić detekcję poszczególnych fragmentów. W tym celu możliwe jest także stosowanie didezoksynukleotydów (dNTP) znakowanych radioaktywnym izotopem. Radioaktywne produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, otrzymuje się obraz wielu fragmentów, składających się na sekwencję komplementarną, w momencie gdy rozpoznawalne ddNTP „czytane są” od najmniejszych do największych rozdzielonych fragmentów.

W laboratoriach obecnie używa się automatycznych sekwenatorów, gdzie rozdział fragmentów DNA przebiega w specjalnych kapilarach wypełnionych żelem, a sygnał od znakowanych nukleotydów ma postać fali o określonej długości i jest przesyłany przez detektor do komputera.

Poznane sekwencje DNA wielu organizmów są przechowywane w bankach danych. Jednakże same te informacje są mało użyteczne do momentu, gdy nie zostanie wykryte ich znaczenie biologiczne.

W miarę zwiększania się liczby danych dotyczących sekwencji nukleotydowych wrasta zapotrzebowanie na coraz bardziej wyrafinowane techniki komputerowe, i coraz większego znaczenia nabiera obecnie współpraca między biologami, informatykami a biologami. Ze względu na ogrom informacji, które dostarcza obecnie współczesna nauka, niezbędnymi narzędziami stał się komputer oraz specjalizacyjne opragramowania, dzięki czemu  możliwe jest zarówno przechowywanie jak i obróbka zebranych w laboratoriach danych. Dzięki nowym technologiom możliwe jest przeszukiwanie powszechnie dostępnych w Internecie baz sekwencji DNA. Daną sekwencję można porównać ze wszystkimi sekwencjami zarejestrowanymi w danej bazie, a następnie znaleźć podobieństwa i różnice miedzy nimi.

ŹRÓDŁO (AUTOR)

Nowak Z. Gruszyczyńska J. 2007. Wybrane techniki i metody analizy DNA. Wydawnictwo SGGW.

Polak-Berecka M. 2006. Genetyka populacyjna drzew leśnych. Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Krakowie